Diolch i chi am ymweld â nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell defnyddio'r fersiwn porwr diweddaraf (neu analluogi'r modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, bydd y wefan hon yn rhydd o arddulliau a JavaScript.
Mae cyhyr ysgerbydol yn feinwe heterogenaidd sy'n cynnwys myofibriliau yn bennaf, ac mewn bodau dynol fe'u dosbarthir fel arfer yn dair math: un "araf" (math 1) a dau "cyflym" (mathau 2A a 2X). Fodd bynnag, mae heterogenedd rhwng ac o fewn mathau traddodiadol o myofibriliau yn parhau i fod heb fawr o ddealltwriaeth. Fe wnaethom gymhwyso dulliau trawsgrifiomig a phroteomig i 1050 a 1038 o myofibriliau unigol o vastus lateralis dynol, yn y drefn honno. Roedd yr astudiaeth proteomig yn cynnwys dynion, ac roedd yr astudiaeth drawsgrifiomig yn cynnwys 10 dyn a 2 fenyw. Yn ogystal ag isoformau cadwyn drwm myosin, fe wnaethom nodi proteinau metabolaidd, proteinau ribosomaidd, a phroteinau cyffordd cellog fel ffynonellau amrywioldeb rhyng-myofibril amlddimensiwn. Ar ben hynny, er gwaethaf nodi clystyrau o ffibrau araf a chyflym, mae ein data yn awgrymu nad oes modd gwahaniaethu rhwng ffibrau math 2X yn ffenoteipig o ffibrau eraill sy'n plygu'n gyflym. Ar ben hynny, nid yw dosbarthiad yn seiliedig ar gadwyn drwm myosin yn ddigonol i ddisgrifio'r ffenoteip myofibr mewn myopathïau nemaline. At ei gilydd, mae ein data yn awgrymu heterogenedd myoffibr amlddimensiwn, gyda ffynonellau amrywiad yn ymestyn y tu hwnt i isofformau cadwyn drwm myosin.
Mae heterogenedd cellog yn nodwedd gynhenid o bob system fiolegol, gan ganiatáu i gelloedd arbenigo i ddiwallu gwahanol anghenion meinweoedd a chelloedd.1 Y farn draddodiadol o heterogenedd ffibrau cyhyrau ysgerbydol fu bod niwronau modur yn diffinio'r math o ffibr o fewn uned fodur, a bod y math o ffibr (h.y., math 1, math 2A, a math 2X mewn bodau dynol) yn cael ei bennu gan nodweddion isoformau cadwyn drwm myosin (MYH).2 Roedd hyn yn seiliedig i ddechrau ar eu hansefydlogrwydd pH ATPase,3,4 ac yn ddiweddarach ar eu mynegiant moleciwlaidd o MYH.5 Fodd bynnag, gyda nodi a derbyn dilynol ffibrau "cymysg" sy'n cyd-fynegi MYHs lluosog mewn cyfrannau amrywiol, mae ffibrau cyhyrau ysgerbydol yn cael eu hystyried fwyfwy fel continwwm yn hytrach nag fel mathau o ffibr ar wahân.6 Er gwaethaf hyn, mae'r maes yn dal i ddibynnu'n fawr ar MYH fel y prif ddosbarthwr ar gyfer dosbarthu myoffibr, barn sy'n debygol o gael ei dylanwadu gan gyfyngiadau a rhagfarnau sylweddol astudiaethau cnofilod cynnar y mae eu proffiliau mynegiant MYH ac ystod o fathau o ffibr yn wahanol i'r rhai mewn bodau dynol.2 Mae'r sefyllfa'n cael ei chymhlethu ymhellach gan y ffaith bod gwahanol gyhyrau ysgerbydol dynol yn arddangos ystod amrywiol o fathau o ffibr.7 Y Mae vastus lateralis yn gyhyr cymysg gyda phroffil mynegiant MYH canolradd (ac felly cynrychioliadol).7 Ar ben hynny, mae ei hwylustod samplu yn ei wneud y cyhyr sydd wedi'i astudio orau mewn bodau dynol.
Felly, mae ymchwiliad diduedd i amrywiaeth ffibrau cyhyrau ysgerbydol gan ddefnyddio offer "omics" pwerus yn hanfodol ond hefyd yn heriol, yn rhannol oherwydd natur aml-niwcleaidd ffibrau cyhyrau ysgerbydol. Fodd bynnag, mae technolegau trawsgrifiomeg8,9 a phroteomeg10 wedi cael chwyldro o ran sensitifrwydd yn ystod y blynyddoedd diwethaf oherwydd amrywiol ddatblygiadau technolegol, gan ganiatáu dadansoddi cyhyrau ysgerbydol ar benderfyniad un ffibr. O ganlyniad, gwnaed cynnydd sylweddol wrth nodweddu amrywiaeth un ffibr a'u hymateb i ysgogiadau atroffig a heneiddio11,12,13,14,15,16,17,18. Yn bwysig, mae gan y datblygiadau technolegol hyn gymwysiadau clinigol, sy'n caniatáu nodweddu dysreoleiddio sy'n gysylltiedig â chlefydau yn fwy manwl a chywir. Er enghraifft, mae patholeg myopathi nemaline, un o'r clefydau cyhyrau etifeddol mwyaf cyffredin (MIM 605355 a MIM 161800), yn gymhleth ac yn ddryslyd.19,20 Felly, gallai nodweddu dysreoleiddio ffibrau cyhyrau ysgerbydol yn well arwain at ddatblygiadau sylweddol yn ein dealltwriaeth o'r clefyd hwn.
Fe wnaethon ni ddatblygu dulliau ar gyfer dadansoddi trawsgrifio a phroteomig o ffibrau cyhyrau ysgerbydol sengl a ynyswyd â llaw o sbesimenau biopsi dynol a'u cymhwyso i filoedd o ffibrau, gan ganiatáu inni ymchwilio i amrywioldeb cellog ffibrau cyhyrau ysgerbydol dynol. Yn ystod y gwaith hwn, fe wnaethon ni ddangos pŵer ffenoteipio trawsgrifio a phroteomig o ffibrau cyhyrau a nodi proteinau metabolaidd, ribosomaidd, a chyfforddus cellog fel ffynonellau arwyddocaol o amrywioldeb rhyngffibrau. Ar ben hynny, gan ddefnyddio'r llif gwaith proteomig hwn, fe wnaethon ni nodweddu perthnasedd clinigol myopathi nematod mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol sengl, gan ddatgelu symudiad cydlynol tuag at ffibrau an-ocsideiddiol yn annibynnol ar y math o ffibr yn seiliedig ar MYH.
I ymchwilio i amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol dynol, fe wnaethom ddatblygu dau lif gwaith i alluogi dadansoddiad trawsgriftom a phroteom o ffibrau cyhyrau ysgerbydol sengl (Ffigur 1A a Ffigur Atodol 1A). Fe wnaethom ddatblygu ac optimeiddio sawl cam methodolegol, o storio samplau a chadw cyfanrwydd RNA a phrotein i optimeiddio trwybwn ar gyfer pob dull. Ar gyfer dadansoddi trawsgriftom, cyflawnwyd hyn trwy fewnosod codau bar moleciwlaidd penodol i sampl yng ngham cychwynnol trawsgrifiad gwrthdro, gan ganiatáu i 96 o ffibrau gael eu cronni ar gyfer prosesu effeithlon i lawr yr afon. Cyfoethogodd dilyniannu dyfnach (±1 miliwn o ddarlleniadau fesul ffibr) o'i gymharu â dulliau traddodiadol un gell y data trawsgriftom ymhellach. 21 Ar gyfer proteomeg, fe wnaethom ddefnyddio graddiant cromatograffig byr (21 munud) ynghyd â chaffael data DIA-PASEF ar sbectromedr màs timsTOF i optimeiddio dyfnder proteom wrth gynnal trwybwn uchel. 22,23 Er mwyn ymchwilio i amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol iach, fe wnaethom nodweddu trawsgriftomau 1,050 o ffibrau unigol o 14 o roddwyr oedolion iach a phroteomau 1,038 o ffibrau o 5 o roddwyr oedolion iach (Tabl Atodol 1). Yn y papur hwn, cyfeirir at y setiau data hyn fel y trawsgriftomau a'r proteomau 1,000-ffibr, yn y drefn honno. Canfu ein dull gyfanswm o 27,237 o drawsgrifiadau a 2,983 o broteinau yn y dadansoddiadau trawsgriftomig a phroteomig 1,000-ffibr (Ffigur 1A, Setiau Data Atodol 1–2). Ar ôl hidlo'r setiau data trawsgriftomig a phroteomig ar gyfer >1,000 o enynnau a ganfuwyd a 50% o werthoedd dilys fesul ffibr, perfformiwyd dadansoddiadau biowybodeg dilynol ar gyfer 925 a 974 o ffibrau yn y trawsgriftom a'r proteom, yn y drefn honno. Ar ôl hidlo, canfuwyd cyfartaledd o 4257 ± 1557 o enynnau a 2015 ± 234 o broteinau (cymedr ± SD) fesul ffibr, gyda gwahaniaeth cyfyngedig rhwng unigolion (Ffigurau Atodol 1B–C, Setiau Data Atodol 3–4). Fodd bynnag, roedd yr amrywioldeb o fewn y pwnc yn fwy amlwg ar draws y cyfranogwyr, yn ôl pob tebyg oherwydd gwahaniaethau mewn cynnyrch RNA/protein rhwng ffibrau o wahanol hyd ac arwynebeddau trawsdoriadol. Ar gyfer y rhan fwyaf o broteinau (>2000), roedd y cyfernod amrywiad yn is na 20% (Ffigur Atodol 1D). Roedd y ddau ddull yn caniatáu cipio ystod ddeinamig eang o drawsgrifiadau a phroteinau gyda llofnodion â mynegiant uchel sy'n bwysig ar gyfer crebachiad cyhyrau (e.e., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Ffigurau Atodol 1E–F). Roedd y rhan fwyaf o'r nodweddion a nodwyd yn gyffredin rhwng y setiau data trawsgrifiadol a phroteomig (Ffigur Atodol 1G), ac roedd dwysterau UMI/LFQ cymedrig y nodweddion hyn yn cydberthyn yn rhesymol dda (r = 0.52) (Ffigur Atodol 1H).
Llif gwaith trawsgriftomeg a phroteomeg (wedi'i greu gyda BioRender.com). Cromliniau amrediad deinamig BD ar gyfer MYH7, MYH2, a MYH1, a throthwyon cyfrifedig ar gyfer neilltuo math o ffibr. E, F Dosbarthiad mynegiant MYH ar draws ffibrau mewn setiau data trawsgriftomeg a phroteomeg. G, H Plotiau Brasamcan ac Amcangyfrif Amrywiaeth Unffurf (UMAP) ar gyfer trawsgriftomeg a phroteomeg wedi'u lliwio yn ôl math o ffibr sy'n seiliedig ar MYH. I, J Plotiau nodwedd yn dangos mynegiant MYH7, MYH2, a MYH1 mewn setiau data trawsgriftomeg a phroteomeg.
I ddechrau, fe wnaethon ni geisio neilltuo math o ffibr yn seiliedig ar MYH i bob ffibr gan ddefnyddio dull wedi'i optimeiddio sy'n manteisio ar sensitifrwydd uchel ac ystod ddeinamig mynegiant MYH mewn setiau data omics. Mae astudiaethau blaenorol wedi defnyddio trothwyon mympwyol i labelu ffibrau fel math 1 pur, math 2A, math 2X, neu gymysg yn seiliedig ar ganran sefydlog o fynegiant gwahanol MYHs11,14,24. Fe wnaethon ni ddefnyddio dull gwahanol lle cafodd mynegiant pob ffibr ei restru yn ôl y MYHs a ddefnyddiwyd gennym i deipio'r ffibrau: MYH7, MYH2, a MYH1, sy'n cyfateb i ffibrau math 1, math 2A, a math 2X, yn y drefn honno. Yna fe wnaethon ni gyfrifo'n fathemategol y pwynt plygu isaf o bob cromlin sy'n deillio o hyn a'i ddefnyddio fel trothwy i neilltuo ffibrau fel rhai positif (uwchlaw'r trothwy) neu negatif (islaw'r trothwy) ar gyfer pob MYH (Ffigur 1B–D). Mae'r data hyn yn dangos bod gan MYH7 (Ffigur 1B) a MYH2 (Ffigur 1C) broffiliau mynegiant ymlaen/i ffwrdd mwy gwahanol ar lefel yr RNA o'i gymharu â lefel y protein. Yn wir, ar lefel y protein, ychydig iawn o ffibrau nad oeddent yn mynegi MYH7, ac nid oedd gan unrhyw ffibr fynegiant MYH2 100%. Nesaf, defnyddiwyd trothwyon mynegiant rhagnodedig i aseinio mathau o ffibrau sy'n seiliedig ar MYH i bob ffibr ym mhob set ddata. Er enghraifft, aseinio ffibrau MYH7+/MYH2-/MYH1- i fath 1, tra aseinio ffibrau MYH7-/MYH2+/MYH1+ i fath cymysg 2A/2X (gweler Tabl Atodol 2 am ddisgrifiad llawn). Wrth gronni'r holl ffibrau, gwelsom ddosbarthiad rhyfeddol o debyg o fathau o ffibrau sy'n seiliedig ar MYH ar lefelau'r RNA (Ffigur 1E) a'r protein (Ffigur 1F), tra bod cyfansoddiad cymharol mathau o ffibrau sy'n seiliedig ar MYH yn amrywio ar draws unigolion, fel y disgwyliwyd (Ffigur Atodol 2A). Dosbarthwyd y rhan fwyaf o ffibrau fel math pur 1 (34–35%) neu fath 2A (36–38%), er bod nifer sylweddol o ffibrau cymysg math 2A/2X hefyd wedi'u canfod (16–19%). Gwahaniaeth trawiadol yw mai dim ond ar lefel yr RNA y gellid canfod ffibrau math 2X pur, ond nid ar lefel y protein, sy'n awgrymu bod mynegiant cyflym MYH yn cael ei reoleiddio o leiaf yn rhannol ar ôl trawsgrifio.
Fe wnaethon ni ddilysu ein dull teipio ffibrau MYH yn seiliedig ar broteomeg gan ddefnyddio dot blotio yn seiliedig ar wrthgyrff, a chyflawnodd y ddau ddull gytundeb o 100% wrth nodi ffibrau pur math 1 a math 2A (gweler Ffigur Atodol 2B). Fodd bynnag, roedd y dull yn seiliedig ar broteomeg yn fwy sensitif, yn fwy effeithlon wrth nodi ffibrau cymysg, a meintioli cyfran pob genyn MYH ym mhob ffibr. Mae'r data hyn yn dangos effeithiolrwydd defnyddio dull gwrthrychol, hynod sensitif yn seiliedig ar omeg i nodweddu mathau o ffibrau cyhyrau ysgerbydol.
Yna fe wnaethom ddefnyddio'r wybodaeth gyfunol a ddarparwyd gan drawsgriftomeg a phroteomeg i ddosbarthu myoffibrau yn wrthrychol yn seiliedig ar eu trawsgriftom neu broteom cyflawn. Gan ddefnyddio'r dull brasamcan a thafluniad manifold unffurf (UMAP) i leihau'r dimensiwn i chwe phrif gydran (Ffigurau Atodol 3A–B), roeddem yn gallu delweddu amrywioldeb myoffibrau yn y trawsgriftom (Ffigur 1G) a'r proteom (Ffigur 1H). Yn nodedig, ni chafodd myoffibrau eu grwpio yn ôl cyfranogwyr (Ffigurau Atodol 3C–D) na diwrnodau profi (Ffigur Atodol 3E) naill ai yn y setiau data trawsgriftomeg na phroteomeg, gan awgrymu bod amrywioldeb o fewn pynciau mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol yn uwch nag amrywioldeb rhwng pynciau. Yn y plot UMAP, daeth dau glwstwr gwahanol i'r amlwg yn cynrychioli myoffibrau "cyflym" ac "araf" (Ffigurau 1G–H). Roedd myoffibrau MYH7+ (araf) wedi'u clystyru wrth begwn positif UMAP1, tra bod myoffibrau MYH2+ a MYH1+ (cyflym) wedi'u clystyru wrth begwn negatif UMAP1 (Ffigurau 1I–J). Fodd bynnag, ni wahaniaethwyd rhwng mathau o ffibrau cyflym (h.y., math 2A, math 2X, neu 2A/2X cymysg) yn seiliedig ar fynegiant MYH, sy'n awgrymu nad yw mynegiant MYH1 (Ffigur 1I–J) na marcwyr myoffibr 2X clasurol eraill fel ACTN3 neu MYLK2 (Ffigurau Atodol 4A–B) yn gwahaniaethu rhwng gwahanol fathau o myoffibrau wrth ystyried y trawsgriftom neu'r proteom cyfan. Ar ben hynny, o'i gymharu â MYH2 a MYH7, ychydig o drawsgrifiadau neu broteinau oedd â chydberthynas gadarnhaol â MYH1 (Ffigau Atodol 4C–H), sy'n awgrymu nad yw helaethrwydd MYH1 yn adlewyrchu'r trawsgriftom/proteom myoffibr yn llawn. Daethpwyd i gasgliadau tebyg wrth asesu mynegiant cymysg y tri isoform MYH ar lefel UMAP (Ffigau Atodol 4I–J). Felly, er y gellir adnabod ffibrau 2X ar lefel y trawsgrifiad yn seiliedig ar feintioli MYH yn unig, nid oes modd gwahaniaethu rhwng ffibrau MYH1+ a ffibrau cyflym eraill wrth ystyried y trawsgrifiadom neu'r proteom cyfan.
Fel archwiliad cychwynnol o heterogenedd ffibrau araf y tu hwnt i MYH, fe wnaethom asesu pedwar protein penodol i fath ffibrau araf sefydledig: TPM3, TNNT1, MYL3, ac ATP2A22. Dangosodd isdeipiau ffibrau araf gydberthnasau Pearson uchel, er nad yn berffaith, gyda MYH7 mewn trawsgrifiadomeg (Ffigur Atodol 5A) a phroteomeg (Ffigur Atodol 5B). Ni chafodd tua 25% a 33% o ffibrau araf eu dosbarthu fel ffibrau araf pur gan bob isdeip gen/protein mewn trawsgrifiadomeg (Ffigur Atodol 5C) a phroteomeg (Ffigur Atodol 5D), yn y drefn honno. Felly, mae dosbarthu ffibrau araf yn seiliedig ar isdeipiau gen/protein lluosog yn cyflwyno cymhlethdod ychwanegol, hyd yn oed ar gyfer proteinau y gwyddys eu bod yn benodol i fath ffibr. Mae hyn yn awgrymu nad yw dosbarthu ffibrau yn seiliedig ar isoffurfiau o un teulu gen/protein o reidrwydd yn adlewyrchu gwir heterogenedd ffibrau cyhyrau ysgerbydol yn ddigonol.
Er mwyn archwilio ymhellach amrywioldeb ffenoteip ffibrau cyhyrau ysgerbydol dynol ar raddfa'r model omics cyfan, fe wnaethom ni gynnal gostyngiad dimensiynoldeb diduedd o'r data gan ddefnyddio dadansoddiad cydrannau prif (PCA) (Ffigur 2A). Yn debyg i blotiau UMAP, ni ddylanwadodd y cyfranogwr na'r diwrnod profi ar glystyru ffibrau ar lefel PCA (Ffigurau Atodol 6A–C). Yn y ddau set ddata, esboniwyd y math o ffibr yn seiliedig ar MYH gan PC2, a ddangosodd glwstwr o ffibrau math 1 twitch araf ac ail glwstwr yn cynnwys ffibrau math 2A twitch cyflym, math 2X, a ffibrau cymysg 2A/2X (Ffigur 2A). Yn y ddau set ddata, roedd y ddau glwstwr hyn wedi'u cysylltu gan nifer fach o ffibrau cymysg math 1/2A. Fel y disgwyliwyd, cadarnhaodd dadansoddiad gor-gynrychiolaeth o'r prif yrwyr PC fod PC2 yn cael ei yrru gan lofnodion cyfangol a metabolaidd (Ffigur 2B a Ffigurau Atodol 6D–E, Setiau Data Atodol 5–6). At ei gilydd, canfuwyd bod y math o ffibr yn seiliedig ar MYH yn ddigonol i esbonio amrywiad parhaus ar hyd PC2, ac eithrio'r hyn a elwir yn ffibrau 2X a oedd wedi'u dosbarthu ledled y trawsgriftom o fewn y clwstwr cyflym.
A. Plotiau dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA) o setiau data trawsgriftom a phroteom wedi'u lliwio yn ôl math o ffibr yn seiliedig ar MYH. B. Dadansoddiad cyfoethogi o yrwyr trawsgrif a phrotein yn PC2 a PC1. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio'r pecyn clusterProfiler a gwerthoedd-p wedi'u haddasu gan Benjamini-Hochberg. C, D. Plotiau PCA wedi'u lliwio yn ôl termau ontoleg genynnau adlyniad rhynggellog (GO) yn nhermau GO y trawsgriftom a'r costamere yn y proteom. Mae'r saethau'n cynrychioli gyrwyr trawsgrif a phrotein a'u cyfeiriadau. E, F. Plotiau nodwedd brasamcan a thafluniad maniffold unffurf (UMAP) o nodweddion perthnasol yn glinigol sy'n dangos graddiannau mynegiant yn annibynnol ar fath o ffibr araf/cyflym. G, H. Cydberthnasau rhwng gyrwyr PC2 a PC1 mewn trawsgriftomau a phroteomau.
Yn annisgwyl, dim ond yr ail radd uchaf o amrywioldeb (PC2) a eglurodd y math myoffibr sy'n seiliedig ar MYH, gan awgrymu bod ffactorau biolegol eraill nad ydynt yn gysylltiedig â math myoffibr sy'n seiliedig ar MYH (PC1) yn chwarae rhan bwysig wrth reoleiddio amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol. Datgelodd dadansoddiad gor-gynrychiolaeth o'r prif yrwyr yn PC1 fod amrywioldeb yn PC1 wedi'i bennu'n bennaf gan adlyniad cell-gell a chynnwys ribosom yn y trawsgriftom, a chostamerau a phroteinau ribosom yn y proteom (Ffigur 2B a Ffigurau Atodol 6D–E, Set Ddata Atodol 7). Mewn cyhyrau ysgerbydol, mae costamerau'n cysylltu'r ddisg-Z â'r sarcolemma ac maent yn ymwneud â throsglwyddo grym a signalau. 25 Datgelodd plotiau PCA wedi'u hanodio gan ddefnyddio nodweddion adlyniad cell-gell (trawsgriftom, Ffigur 2C) a chostamer (proteom, Ffigur 2D) symudiad cryf i'r chwith yn PC1, gan ddangos bod y nodweddion hyn wedi'u cyfoethogi mewn rhai ffibrau.
Datgelodd archwiliad mwy manwl o glystyru myoffibrau ar lefel UMAP fod y rhan fwyaf o'r nodweddion yn arddangos graddiant mynegiant seiliedig ar MYH sy'n annibynnol ar fath myoffibr yn hytrach nag is-glwstwr myoffibr penodol. Gwelwyd y parhad hwn ar gyfer sawl genyn sy'n gysylltiedig â chyflyrau patholegol (Ffigur 2E), megis CHCHD10 (clefyd niwrogyhyrol), SLIT3 (atroffi cyhyrau), CTDNEP1 (clefyd cyhyrau). Gwelwyd y parhad hwn hefyd ar draws y proteom, gan gynnwys proteinau sy'n gysylltiedig ag anhwylderau niwrolegol (UGDH), signalau inswlin (PHIP), a thrawsgrifio (HIST1H2AB) (Ffigur 2F). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos parhad mewn heterogenedd twitch araf/cyflym annibynnol ar fath ffibr ar draws gwahanol myoffibrau.
Yn ddiddorol, dangosodd genynnau gyrrwr yn PC2 gydberthynas drawsgriftom-proteom dda (r = 0.663) (Ffigur 2G), gan awgrymu bod mathau o ffibrau sy'n plygu'n araf ac yn gyflym, ac yn benodol priodweddau cyfangol a metabolaidd ffibrau cyhyrau ysgerbydol, yn cael eu rheoleiddio'n drawsgrifiadol. Fodd bynnag, ni ddangosodd genynnau gyrrwr yn PC1 unrhyw gydberthynas drawsgriftom-proteom (r = -0.027) (Ffigur 2H), gan awgrymu bod amrywiadau nad ydynt yn gysylltiedig â mathau o ffibrau sy'n plygu'n araf/yn gyflym yn cael eu rheoleiddio'n bennaf ar ôl trawsgrifio. Gan fod amrywiadau yn PC1 wedi'u hesbonio'n bennaf gan dermau ontoleg genynnau ribosomaidd, ac o ystyried bod ribosomau'n chwarae rhan hanfodol ac arbenigol yn y gell trwy gymryd rhan weithredol mewn cyfieithu protein a dylanwadu arno,31 fe wnaethom ni nesaf geisio ymchwilio i'r amrywioldeb ribosomaidd annisgwyl hwn.
Yn gyntaf, lliwiwyd plot dadansoddi prif gydrannau'r proteomeg yn ôl nifer gymharol y proteinau yn nherm GOCC "ribosom cytoplasmig" (Ffigur 3A). Er bod y term hwn wedi'i gyfoethogi ar ochr bositif PC1, gan arwain at raddiant bach, mae proteinau ribosomaidd yn gyrru rhannu i'r ddau gyfeiriad o PC1 (Ffigur 3A). Roedd proteinau ribosomaidd wedi'u cyfoethogi ar ochr negyddol PC1 yn cynnwys RPL18, RPS18, ac RPS13 (Ffigur 3B), tra bod RPL31, RPL35, ac RPL38 (Ffigur 3C) yn brif yrwyr ar ochr bositif PC1. Yn ddiddorol, roedd RPL38 ac RPS13 wedi'u mynegi'n fawr mewn cyhyrau ysgerbydol o'i gymharu â meinweoedd eraill (Ffigur Atodol 7A). Ni welwyd yr arwyddion ribosomaidd nodedig hyn yn PC1 yn y trawsgrifiadom (Ffigur Atodol 7B), sy'n dynodi rheoleiddio ôl-drawsgrifio.
A. Plot dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA) wedi'i liwio yn ôl termau ontoleg genynnau ribosom cytoplasmig (GO) ar draws y proteom. Mae'r saethau'n dangos cyfeiriad yr amrywiad a gyfryngir gan brotein yn y plot PCA. Mae hyd y llinell yn cyfateb i'r sgôr cydrannau pennaf ar gyfer protein penodol. B, C. Plotiau nodwedd PCA ar gyfer RPS13 ac RPL38. D. Dadansoddiad clystyru hierarchaidd heb oruchwyliaeth o broteinau ribosom cytoplasmig. E. Model strwythurol o'r ribosom 80S (PDB: 4V6X) yn tynnu sylw at broteinau ribosomig â gwahanol niferoedd mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol. F. Proteinau ribosomig â stoichiometreg wahanol wedi'u lleoli ger sianel allanfa mRNA.
Cynigiwyd y cysyniadau o heterogenedd ac arbenigedd ribosomaidd o'r blaen, lle gall presenoldeb is-boblogaethau ribosomaidd gwahanol (heterogenedd ribosomaidd) ddylanwadu'n uniongyrchol ar gyfieithu protein mewn gwahanol feinweoedd32 a chelloedd33 trwy gyfieithu dethol pyllau trawsgrifiad mRNA penodol34 (arbenigedd ribosomaidd). Er mwyn nodi is-boblogaethau o broteinau ribosomaidd a fynegir ar y cyd mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol, gwnaethom ddadansoddiad clystyru hierarchaidd heb oruchwyliaeth o broteinau ribosomaidd yn y proteom (Ffigur 3D, Set Ddata Atodol 8). Fel y disgwyliwyd, ni wnaeth proteinau ribosomaidd glystyru yn ôl math o ffibr yn seiliedig ar MYH. Fodd bynnag, nodwyd tri chlwstwr gwahanol o broteinau ribosomaidd; mae'r clwstwr cyntaf (clwstwr_ribosomaidd_1) wedi'i gydreoleiddio ag RPL38 ac felly mae ganddo fynegiant cynyddol mewn ffibrau â phroffil PC1 positif. Mae'r ail glwstwr (clwstwr_ribosomaidd_2) wedi'i gydreoleiddio ag RPS13 ac mae wedi'i uchel mewn ffibrau â phroffil PC1 negyddol. Nid yw'r trydydd clwstwr (clwstwr_ribosomal_3) yn dangos mynegiant gwahaniaethol cydlynol mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol a gellir ei ystyried yn brotein ribosomal cyhyrau ysgerbydol "craidd". Mae clwstwr ribosomal 1 a 2 ill dau yn cynnwys proteinau ribosomal y dangoswyd yn flaenorol eu bod yn rheoleiddio cyfieithu amgen (e.e., RPL10A, RPL38, RPS19, ac RPS25) ac yn dylanwadu'n swyddogaethol ar ddatblygiad (e.e., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Yn gyson â chanlyniadau'r PCA, dangosodd y gynrychiolaeth heterogenaidd a welwyd o'r proteinau ribosomal hyn ar draws ffibrau barhad hefyd (Ffigur Atodol 7C).
I ddelweddu lleoliad proteinau ribosom heterogenaidd o fewn y ribosom, fe wnaethom ddefnyddio model strwythurol o'r ribosom 80S dynol (Banc Data Protein: 4V6X) (Ffigur 3E). Ar ôl ynysu proteinau ribosom sy'n perthyn i wahanol glystyrau ribosom, nid oedd eu lleoliadau wedi'u halinio'n agos, gan awgrymu bod ein dull wedi methu â darparu cyfoethogi ar gyfer rhai rhanbarthau/ffracsiynau o'r ribosom. Yn ddiddorol, fodd bynnag, roedd cyfran y proteinau is-uned mawr yng nghlwstwr 2 yn is nag yng nghlystyrau 1 a 3 (Ffigur Atodol 7D). Gwelsom fod proteinau â stoichiometreg wedi'i newid mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol wedi'u lleoli'n bennaf i wyneb y ribosom (Ffigur 3E), yn gyson â'u gallu i ryngweithio ag elfennau safle mynediad ribosom mewnol (IRES) mewn gwahanol boblogaethau mRNA, a thrwy hynny gydlynu cyfieithu dethol. 40, 41 Ar ben hynny, roedd llawer o broteinau â stoichiometreg wedi'i newid mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol wedi'u lleoli ger rhanbarthau swyddogaethol fel twnnel allanfa'r mRNA (Ffigur 3F), sy'n rheoleiddio ymestyn cyfieithu ac atal peptidau penodol yn ddetholus. 42 I grynhoi, mae ein data yn awgrymu bod stoichiometreg proteinau ribosom cyhyrau ysgerbydol yn arddangos heterogenedd, gan arwain at wahaniaethau rhwng ffibrau cyhyrau ysgerbydol.
Nesaf, fe wnaethom ni geisio nodi llofnodion ffibrau plygu cyflym ac araf ac archwilio mecanweithiau eu rheoleiddio trawsgrifio. Wrth gymharu'r clystyrau ffibrau plygu cyflym ac araf a ddiffiniwyd gan UMAP yn y ddau set ddata (Ffigurau 1G–H a 4A–B), nododd dadansoddiadau trawsgrifiomig a phroteomig 1366 ac 804 o nodweddion toreithiog yn wahanol, yn y drefn honno (Ffigurau 4A–B, Setiau Data Atodol 9–12). Gwelsom y gwahaniaethau disgwyliedig mewn llofnodion yn gysylltiedig â sarcomerau (e.e., tropomyosin a throponin), cyplu cyffroi-crebachu (isoformau SERCA), a metaboledd ynni (e.e., ALDOA a CKB). Ar ben hynny, mynegwyd trawsgrifiadau a phroteinau sy'n rheoleiddio ubiquitineiddio protein yn wahanol mewn ffibrau plygu cyflym ac araf (e.e., USP54, SH3RF2, USP28, ac USP48) (Ffigurau 4A–B). Ar ben hynny, cafodd y genyn protein microbaidd RP11-451G4.2 (DWORF), sydd wedi'i ddangos yn flaenorol i gael ei fynegi'n wahanol ar draws mathau o ffibrau cyhyrau oen43 ac yn gwella gweithgaredd SERCA mewn cyhyr cardiaidd44, ei uwchreoleiddio'n sylweddol mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol araf (Ffigur 4A). Yn yr un modd, ar lefel y ffibr unigol, gwelwyd gwahaniaethau sylweddol mewn llofnodion hysbys megis isoformau lactad dehydrogenase sy'n gysylltiedig â metaboledd (LDHA ac LDHB, Ffigur 4C a Ffigur Atodol 8A)45,46 yn ogystal â llofnodion penodol i fath o ffibr nad oeddent yn hysbys o'r blaen (megis IRX3, USP54, USP28, a DPYSL3) (Ffigur 4C). Roedd gorgyffwrdd sylweddol o nodweddion a fynegir yn wahanol rhwng y setiau data trawsgrifiadol a phroteomig (Ffigur Atodol 8B), yn ogystal â chydberthynas newid plyg a yrrir yn bennaf gan y mynegiant gwahaniaethol mwy amlwg o nodweddion sarcomere (Ffigur Atodol 8C). Yn nodedig, dangosodd rhai llofnodion (e.e. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) reoleiddio ôl-drawsgrifiadol cryf ar y lefel proteomig yn unig ac roedd ganddynt broffiliau mynegiant penodol i fath ffibr twitch araf/cyflym (Ffigur Atodol 8C).
Plotiau llosgfynydd A a B yn cymharu clystyrau araf a chyflym a nodwyd gan y plotiau brasamcan a thafluniad manifold unffurf (UMAP) yn Ffigurau 1G–H. Mae dotiau lliw yn cynrychioli trawsgrifiadau neu broteinau sy'n sylweddol wahanol ar FDR < 0.05, ac mae dotiau tywyllach yn cynrychioli trawsgrifiadau neu broteinau sy'n sylweddol wahanol ar newid log > 1. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol dwyffordd gan ddefnyddio prawf DESeq2 Wald gyda gwerthoedd p wedi'u haddasu gan Benjamini-Hochberg (trawsgrifiadomeg) neu'r dull model llinol Limma gyda dadansoddiad Bayesaidd empirig ac yna addasiad Benjamini-Hochberg ar gyfer cymhariaethau lluosog (proteomeg). C Plotiau llofnod o enynnau neu broteinau a fynegir yn wahaniaethol rhwng ffibrau araf a chyflym. D Dadansoddiad cyfoethogi o drawsgrifiadau a phroteinau a fynegir yn wahaniaethol sylweddol. Mae gwerthoedd sy'n gorgyffwrdd wedi'u cyfoethogi yn y ddau set ddata, mae gwerthoedd trawsgrifiadom yn cael eu cyfoethogi yn y trawsgrifiadom yn unig, ac mae gwerthoedd proteom yn cael eu cyfoethogi yn y proteom yn unig. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio'r pecyn clusterProfiler gyda gwerthoedd-p wedi'u haddasu gan Benjamini-Hochberg. E. Ffactorau trawsgrifio penodol i fath o ffibr a nodwyd gan SCENIC yn seiliedig ar sgoriau penodolrwydd rheoleiddwyr sy'n deillio o SCENIC a mynegiant mRNA gwahaniaethol rhwng mathau o ffibrau. F. Proffilio ffactorau trawsgrifio dethol a fynegir yn wahanol rhwng ffibrau araf a chyflym.
Yna fe wnaethom gynnal dadansoddiad gor-gynrychiolaeth o enynnau a phroteinau a gynrychiolwyd yn wahanol (Ffigur 4D, Set Ddata Atodol 13). Datgelodd cyfoethogi llwybrau ar gyfer nodweddion a oedd yn wahanol rhwng y ddau set ddata wahaniaethau disgwyliedig, megis prosesau metaboledd ceton a β-ocsidiad asid brasterog (ffibrau araf), crebachiad myofilament/cyhyrau (ffibrau cyflym ac araf, yn y drefn honno), a phrosesau catabolaidd carbohydrad (ffibrau cyflym). Roedd gweithgaredd ffosffatas protein serin/threonin hefyd yn uwch mewn ffibrau cyflym, wedi'i yrru gan nodweddion megis yr is-unedau ffosffatas rheoleiddiol a chatalytig (PPP3CB, PPP1R3D, a PPP1R3A), y gwyddys eu bod yn rheoleiddio metaboledd glycogen (47) (Ffigurau Atodol 8D–E). Roedd llwybrau eraill a gyfoethogwyd mewn ffibrau cyflym yn cynnwys cyrff prosesu (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) yn y proteom (Ffig. Atodol 8F), a allai fod yn rhan o reoleiddio ôl-drawsgrifio (48), a gweithgaredd ffactor trawsgrifio (SREBF1, RXRG, RORA) yn y trawsgriftom (Ffig. Atodol 8G). Cyfoethogwyd ffibrau araf mewn gweithgaredd ocsidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Ffig. Atodol 8H), rhwymo amid (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Ffig. Atodol 8I), matrics allgellog (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Ffig. Atodol 8J), a gweithgaredd derbynnydd-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Ffig. Atodol 8K).
Er mwyn cael rhagor o fewnwelediad i'r rheoleiddio trawsgrifio sy'n sail i nodweddion math ffibrau cyhyrau araf/cyflym, fe wnaethom gynnal dadansoddiad cyfoethogi ffactorau trawsgrifio gan ddefnyddio SCENIC49 (Set Ddata Atodol 14). Roedd llawer o ffactorau trawsgrifio wedi'u cyfoethogi'n sylweddol rhwng ffibrau cyhyrau cyflym ac araf (Ffigur 4E). Roedd hyn yn cynnwys ffactorau trawsgrifio fel MAFA, sydd wedi'i gysylltu'n flaenorol â datblygiad ffibrau cyhyrau cyflym,50 yn ogystal â sawl ffactor trawsgrifio nad oeddent yn gysylltiedig o'r blaen â rhaglenni genynnau penodol i fath ffibrau cyhyrau. Ymhlith y rhain, PITX1, EGR1, a MYF6 oedd y ffactorau trawsgrifio mwyaf cyfoethog mewn ffibrau cyhyrau cyflym (Ffigur 4E). Mewn cyferbyniad, ZSCAN30 ac EPAS1 (a elwir hefyd yn HIF2A) oedd y ffactorau trawsgrifio mwyaf cyfoethog mewn ffibrau cyhyrau araf (Ffigur 4E). Yn gyson â hyn, mynegwyd MAFA ar lefelau uwch yn rhanbarth UMAP sy'n cyfateb i ffibrau cyhyrau cyflym, tra bod gan EPAS1 y patrwm mynegiant gwrthwynebol (Ffigur 4F).
Yn ogystal â genynnau hysbys sy'n codio proteinau, mae nifer o fioteipiau RNA nad ydynt yn codio a allai fod yn rhan o reoleiddio datblygiad a chlefyd dynol. 51, 52 Mewn setiau data trawsgriftom, mae sawl RNA nad ydynt yn codio yn arddangos penodolrwydd math o ffibr (Ffigur 5A a Set Ddata Atodol 15), gan gynnwys LINC01405, sy'n benodol iawn ar gyfer ffibrau araf ac a adroddir ei fod wedi gostwng mewn cyhyrau gan gleifion â myopathi mitocondriaidd. 53 Mewn cyferbyniad, mae RP11-255P5.3, sy'n cyfateb i'r genyn lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, yn arddangos penodolrwydd math o ffibr cyflym. Mae LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) a RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ill dau yn arddangos penodolrwydd cyhyrau ysgerbydol (Ffigurau Atodol 9A–B) ac nid oes ganddynt unrhyw enynnau cyfangol hysbys o fewn eu cymdogaeth genomig 1 Mb, sy'n awgrymu eu bod yn chwarae rhan arbenigol wrth reoleiddio mathau o ffibrau yn hytrach na rheoleiddio genynnau cyfangol cyfagos. Cadarnhawyd proffiliau mynegiant araf/cyflym sy'n benodol i fath o ffibr LINC01405 ac RP11-255P5.3, yn y drefn honno, gan ddefnyddio RNAscope (Ffigurau 5B–C).
A. Mae trawsgrifiadau RNA nad ydynt yn codio yn cael eu rheoleiddio'n sylweddol mewn ffibrau cyhyrau sy'n plygu'n araf ac yn gyflym. B. Delweddau RNAscope cynrychioliadol yn dangos manylder math ffibr LINC01405 ac RP11-255P5.3, sy'n plygu'n araf ac yn gyflym, yn y drefn honno. Bar graddfa = 50 μm. C. Mesur mynegiant RNA nad yw'n codio penodol i fath myoffibr fel y'i penderfynwyd gan RNAscope (n = 3 biopsi gan unigolion annibynnol, gan gymharu ffibrau cyhyrau cyflym ac araf o fewn pob unigolyn). Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr dwygynffonog. Mae plotiau blwch yn dangos y canolrif a'r chwartel cyntaf a thrydydd, gyda mwstas yn pwyntio at y gwerthoedd isaf ac uchaf. D. Llif gwaith adnabod protein microbaidd de novo (wedi'i greu gyda BioRender.com). E. Mae'r protein microbaidd LINC01405_ORF408:17441:17358 wedi'i fynegi'n benodol mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol araf (n=5 biopsi gan gyfranogwyr annibynnol, gan gymharu ffibrau cyhyrau cyflym ac araf ym mhob cyfranogwr). Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio dull model llinol Limm ynghyd â dull Bayesaidd empirig, ac yna dull Benjamini-Hochberg ar gyfer cymhariaethau lluosog gydag addasiad gwerth-p. Mae plotiau bocs yn dangos y canolrif, y chwartel cyntaf a'r trydydd chwartel, gyda mwstas yn pwyntio at y gwerthoedd uchaf/isaf.
Yn ddiweddar, mae astudiaethau wedi dangos bod llawer o drawsgrifiadau tybiedig nad ydynt yn codio yn amgodio proteinau microbaidd wedi'u trawsgrifio, ac mae rhai ohonynt yn rheoleiddio swyddogaeth cyhyrau. 44, 55 Er mwyn nodi proteinau microbaidd â phenodoldeb math ffibr posibl, fe wnaethom chwilio ein set ddata proteom 1000 ffibr gan ddefnyddio ffeil FASTA wedi'i haddasu yn cynnwys dilyniannau trawsgrifiadau nad ydynt yn codio (n = 305) a geir yn y set ddata trawsgriftom 1000 ffibr (Ffigur 5D). Fe wnaethom nodi 197 o broteinau microbaidd o 22 trawsgrifiad gwahanol, ac roedd 71 ohonynt wedi'u rheoleiddio'n wahanol rhwng ffibrau cyhyrau ysgerbydol araf a chyflym (Ffigur Atodol 9C a Set Ddata Atodol 16). Ar gyfer LINC01405, nodwyd tri chynnyrch protein microbaidd, ac roedd un ohonynt yn dangos penodoldeb ffibr araf tebyg i'w drawsgrifiad (Ffigur 5E a Ffigur Atodol 9D). Felly, fe wnaethom nodi LINC01405 fel genyn sy'n amgodio protein microbaidd penodol ar gyfer ffibrau cyhyrau ysgerbydol araf.
Fe wnaethom ddatblygu llif gwaith cynhwysfawr ar gyfer nodweddu proteomig ar raddfa fawr o ffibrau cyhyrau unigol a nodi rheoleiddwyr heterogenedd ffibr mewn cyflyrau iach. Fe wnaethom gymhwyso'r llif gwaith hwn i ddeall sut mae myopathïau nemaline yn effeithio ar heterogenedd ffibrau cyhyrau ysgerbydol. Mae myopathïau nemaline yn glefydau cyhyrau etifeddol sy'n achosi gwendid cyhyrau ac, mewn plant yr effeithir arnynt, yn cyflwyno amrywiaeth o gymhlethdodau gan gynnwys trallod anadlol, scoliosis, a symudedd cyfyngedig yn yr aelodau. 19,20 Yn nodweddiadol, mewn myopathïau nemaline, mae amrywiadau pathogenig mewn genynnau fel actin alffa 1 (ACTA1) yn arwain at oruchafiaeth cyfansoddiad myoffibr ffibr araf-twitch, er bod yr effaith hon yn heterogenaidd. Un eithriad nodedig yw myopathi nemaline troponin T1 (TNNT1), sydd â goruchafiaeth o ffibrau cyflym. Felly, gall gwell dealltwriaeth o'r heterogenedd sy'n sail i'r camreoleiddio ffibrau cyhyrau ysgerbydol a welwyd mewn myopathïau nemaline helpu i ddatrys y berthynas gymhleth rhwng y clefydau hyn a math y myoffibr.
O'i gymharu â rheolyddion iach (n=3 fesul grŵp), dangosodd myoffibrau a ynyswyd o gleifion myopathi nemaline â mwtaniadau yn y genynnau ACTA1 a TNNT1 atroffi neu ddystroffi myoffibrau amlwg (Ffigur 6A, Tabl Atodol 3). Cyflwynodd hyn heriau technegol sylweddol ar gyfer dadansoddi proteomig oherwydd y swm cyfyngedig o ddeunydd sydd ar gael. Er gwaethaf hyn, roeddem yn gallu canfod 2485 o broteinau mewn 272 o myoffibrau ysgerbydol. Ar ôl hidlo am o leiaf 1000 o broteinau wedi'u mesur fesul ffibr, cafodd 250 o ffibrau eu dadansoddi'n fiowybodeg ddilynol. Ar ôl hidlo, mesurwyd cyfartaledd o 1573 ± 359 o broteinau fesul ffibr (Ffigur Atodol 10A, Setiau Data Atodol 17–18). Yn nodedig, er gwaethaf y gostyngiad sylweddol ym maint y ffibr, dim ond ychydig bach y gostyngwyd dyfnder proteome samplau cleifion myopathi nemaline. Ar ben hynny, trwy brosesu'r data hyn gan ddefnyddio ein ffeiliau FASTA ein hunain (gan gynnwys trawsgrifiadau di-godio) roedden ni'n gallu nodi pum protein microbaidd mewn myoffibrau ysgerbydol gan gleifion myopathi nemaline (Set Ddata Atodol 19). Roedd ystod ddeinamig y proteom yn sylweddol ehangach, ac roedd cyfanswm y proteinau yn y grŵp rheoli yn cydberthyn yn dda â chanlyniadau dadansoddiad proteom 1000-ffibr blaenorol (Ffig. Atodol 10B–C).
A. Delweddau microsgopig yn dangos atroffi neu ddystroffi ffibrau a goruchafiaeth gwahanol fathau o ffibrau yn seiliedig ar MYH mewn myopathïau nemaline ACTA1 a TNNT1 (NM). Bar graddfa = 100 μm. Er mwyn sicrhau atgynhyrchadwyedd staenio mewn cleifion ACTA1 a TNNT1, staeniwyd tri biopsi claf ddwy i dair gwaith (pedwar adran fesul achos) cyn dewis delweddau cynrychioliadol. B. Cyfrannau math o ffibrau mewn cyfranogwyr yn seiliedig ar MYH. C. Plot dadansoddiad cydrannau prif (PCA) o ffibrau cyhyrau ysgerbydol mewn cleifion â myopathïau nemaline a rheolyddion. D. Ffibrau cyhyrau ysgerbydol o gleifion â myopathïau nemaline a rheolyddion wedi'u taflunio ar blot PCA a bennwyd o'r 1000 o ffibrau a ddadansoddwyd yn Ffigur 2. Er enghraifft, plotiau llosgfynydd yn cymharu gwahaniaethau rhwng cyfranogwyr â myopathïau nemaline ACTA1 a TNNT1 a rheolyddion, a rhwng cyfranogwyr â myopathïau nemaline ACTA1 a TNNT1. Mae cylchoedd lliw yn dynodi proteinau a oedd yn sylweddol wahanol ar π < 0.05, ac mae dotiau tywyll yn dynodi proteinau a oedd yn sylweddol wahanol ar FDR < 0.05. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio'r dull model llinol Limma a dulliau empirig Bayesaidd, ac yna addasiad gwerth-p ar gyfer cymhariaethau lluosog gan ddefnyddio'r dull Benjamini-Hochberg. H. Dadansoddiad cyfoethogi o broteinau a fynegir yn wahaniaethol sylweddol ar draws y proteome cyfan ac mewn ffibrau math 1 a 2A. Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio'r pecyn clusterProfiler a gwerthoedd-p wedi'u haddasu gan Benjamini-Hochberg. I, J. Plotiau dadansoddiad cydrannau prif (PCA) wedi'u lliwio gan dermau matrics allgellog ac ontoleg genynnau mitocondriaidd (GO).
Gan y gall myopathïau nemaline ddylanwadu ar gyfran y mathau o myoffibrau sy'n mynegi MYH mewn cyhyrau ysgerbydol,19,20 fe wnaethom archwilio'r mathau o myoffibrau sy'n mynegi MYH yn gyntaf mewn cleifion â myopathïau nemaline a rheolyddion. Fe wnaethom bennu'r math o myoffibr gan ddefnyddio dull diduedd a ddisgrifiwyd yn flaenorol ar gyfer yr assay 1000 o myoffibrau (Ffigau Atodol 10D–E) ac unwaith eto methodd â nodi myoffibrau 2X pur (Ffigur 6B). Gwelsom effaith heterogenaidd o myopathïau nemaline ar y math o myoffibr, gan fod gan ddau glaf â mwtaniadau ACTA1 gyfran uwch o myoffibrau math 1, tra bod gan ddau glaf â myopathi nemaline TNNT1 gyfran is o myoffibrau math 1 (Ffigur 6B). Yn wir, gostyngodd mynegiant MYH2 ac isoformau troponin cyflym (TNNC2, TNNI2, a TNNT3) mewn myopathïau ACTA1-nemaline, tra gostyngodd mynegiant MYH7 mewn myopathïau TNNT1-nemaline (Ffigur Atodol 11A). Mae hyn yn gyson ag adroddiadau blaenorol o newid math myoffibr heterogenaidd mewn myopathïau nemaline.19,20 Cadarnhawyd y canlyniadau hyn gennym trwy imiwnohistochemeg a chanfuwyd bod gan gleifion â myopathi ACTA1-nemaline oruchafiaeth o myoffibrau math 1, tra bod gan gleifion â myopathi TNNT1-nemaline y patrwm gyferbyn (Ffigur 6A).
Ar lefel y proteom ffibr sengl, roedd ffibrau cyhyrau ysgerbydol o gleifion myopathi nemalin ACTA1 a TNNT1 yn clystyru gyda mwyafrif y ffibrau rheoli, gyda ffibrau myopathi nemalin TNNT1 yn gyffredinol yn cael eu heffeithio fwyaf difrifol (Ffigur 6C). Roedd hyn yn arbennig o amlwg wrth blotio plotiau dadansoddiad cydrannau prif (PCA) o ffibrau ffug-chwyddedig ar gyfer pob claf, gyda chleifion myopathi nemalin TNNT1 2 a 3 yn ymddangos bellaf o samplau rheoli (Ffigur Atodol 11B, Set Ddata Atodol 20). Er mwyn deall yn well sut mae ffibrau o gleifion myopathi yn cymharu â ffibrau iach, fe wnaethom ddefnyddio gwybodaeth fanwl a gafwyd o ddadansoddiad proteomig o 1,000 o ffibrau gan gyfranogwyr oedolion iach. Fe wnaethom daflunnu ffibrau o'r set ddata myopathi (cleifion a rheolyddion myopathi nemalin ACTA1 a TNNT1) ar y plot PCA a gafwyd o'r dadansoddiad proteomig 1000 o ffibrau (Ffigur 6D). Roedd dosbarthiad y mathau o ffibrau MYH ar hyd PC2 mewn ffibrau rheoli yn debyg i'r dosbarthiad ffibr a gafwyd o'r dadansoddiad proteomig 1000-ffibr. Fodd bynnag, symudodd y rhan fwyaf o ffibrau mewn cleifion myopathi nemaline i lawr PC2, gan orgyffwrdd â ffibrau iach sy'n twitchio'n gyflym, waeth beth fo'u math o ffibr MYH brodorol. Felly, er bod cleifion â myopathi nemaline ACTA1 wedi dangos symudiad tuag at ffibrau math 1 pan gafodd eu mesur gan ddefnyddio dulliau sy'n seiliedig ar MYH, symudodd myopathi nemaline ACTA1 a myopathi nemaline TNNT1 y proteom ffibr cyhyrau ysgerbydol tuag at ffibrau sy'n twitchio'n gyflym.
Yna fe wnaethom gymharu pob grŵp cleifion yn uniongyrchol â rheolyddion iach a nodi 256 a 552 o broteinau â mynegiant gwahaniaethol mewn myopathïau nemaline ACTA1 ac TNNT1, yn y drefn honno (Ffigur 6E–G a Ffigur Atodol 11C, Set Data Atodol 21). Datgelodd dadansoddiad cyfoethogi genynnau ostyngiad cydlynol mewn proteinau mitocondriaidd (Ffigur 6H–I, Set Data Atodol 22). Yn syndod, er gwaethaf y gwahaniaeth rhwng y mathau o ffibrau mewn myopathïau nemaline ACTA1 ac TNNT1, roedd y gostyngiad hwn yn gwbl annibynnol ar y math o ffibr yn seiliedig ar MYH (Ffigur 6H a Ffigurau Atodol 11D–I, Set Data Atodol 23). Roedd tri phrotein microbaidd hefyd yn cael eu rheoleiddio mewn myopathïau nemaline ACTA1 neu TNNT1. Dim ond mewn myoffibrau math 1 y dangosodd dau o'r microproteinau hyn, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (a elwir hefyd yn LINC00598 neu Lnc-FOXO1) ac ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), amrywiaeth o ran nifer. Adroddwyd yn flaenorol bod ENSG00000215483_TR14_ORF67 yn chwarae rhan mewn rheoleiddio cylchred celloedd.56 Ar y llaw arall, roedd ENSG00000232046_TR1_ORF437 (sy'n cyfateb i LINC01798) wedi cynyddu mewn myoffibrau math 1 a math 2A mewn myopathi ACTA1-nemaline o'i gymharu â rheolyddion iach (Ffigur Atodol 12A, Set Ddata Atodol 24). Mewn cyferbyniad, nid oedd proteinau ribosomaidd wedi'u heffeithio i raddau helaeth gan myopathi nemaline, er bod RPS17 wedi'i isreoleiddio ym myopathi nemaline ACTA1 (Ffig. 6E).
Datgelodd dadansoddiad cyfoethogi hefyd gynnydd mewn prosesau'r system imiwnedd mewn myopathïau nemalin ACTA1 a TNNT1, tra bod adlyniad celloedd hefyd wedi cynyddu mewn myopathi nemalin TNNT1 (Ffigur 6H). Adlewyrchwyd cyfoethogi'r ffactorau allgellog hyn gan y proteinau matrics allgellog yn symud PCA yn PC1 a PC2 i gyfeiriad negyddol (h.y., tuag at y ffibrau yr effeithir arnynt fwyaf) (Ffigur 6J). Dangosodd y ddau grŵp o gleifion fynegiant cynyddol o broteinau allgellog sy'n ymwneud ag ymatebion imiwnedd a mecanweithiau atgyweirio sarcolemmal, megis atecsinau (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 a'u protein rhyngweithiol S100A1159 (Ffigurau Atodol 12B–C). Adroddwyd yn flaenorol bod y broses hon yn cael ei gwella mewn dystroffiau cyhyrol60 ond, hyd y gwyddom ni, nid yw wedi'i chysylltu o'r blaen â myopathïau nemalin. Mae angen swyddogaeth arferol y peirianwaith moleciwlaidd hwn ar gyfer atgyweirio sarcolemmal yn dilyn anaf ac ar gyfer uno myocytau newydd eu ffurfio â myoffibrau58,61. Felly, mae'r cynnydd mewn gweithgaredd y broses hon yn y ddau grŵp o gleifion yn awgrymu ymateb atgyweirio i anaf a achosir gan ansefydlogrwydd myoffibr.
Roedd effeithiau pob myopathi nemalin wedi'u cydberthyn yn dda (r = 0.736) ac yn dangos gorgyffwrdd rhesymol (Ffigurau Atodol 11A–B), sy'n dangos bod gan myopathi nemalin ACTA1 ac TNNT1 effeithiau tebyg ar y proteom. Fodd bynnag, dim ond mewn myopathi nemalin ACTA1 neu TNNT1 yr oedd rhai proteinau'n cael eu rheoleiddio (Ffigurau Atodol 11A a C). Y protein proffibrotig MFAP4 oedd un o'r proteinau a gafodd eu huwchreoleiddio fwyaf mewn myopathi nemalin TNNT1 ond arhosodd yr un fath mewn myopathi nemalin ACTA1. Cafodd SKIC8, cydran o'r cymhlyg PAF1C sy'n gyfrifol am reoleiddio trawsgrifiad genyn HOX, ei isreoleiddio mewn myopathi nemalin TNNT1 ond ni chafodd ei effeithio mewn myopathi nemalin ACTA1 (Ffigur Atodol 11A). Datgelodd cymhariaeth uniongyrchol rhwng myopathi nemalin ACTA1 a TNNT1 ostyngiadau mwy mewn proteinau mitocondriaidd a chynnydd mewn proteinau system imiwnedd mewn myopathi nemalin TNNT1 (Ffigur 6G–H a Ffigurau Atodol 11C ac 11H–I). Mae'r data hyn yn gyson â'r atroffi/dystroffi mwy a welwyd mewn myopathi nemalin TNNT1 o'i gymharu â myopathi nemalin TNNT1 (Ffigur 6A), gan awgrymu bod myopathi nemalin TNNT1 yn cynrychioli ffurf fwy difrifol o'r clefyd.
Er mwyn asesu a yw effeithiau a welwyd o myopathi nemaline yn parhau ar lefel y cyhyr cyfan, fe wnaethom gynnal dadansoddiad proteomig swmp o fiopsïau cyhyrau o'r un garfan o gleifion myopathi nemaline TNNT1 a'u cymharu â rheolyddion (n=3 fesul grŵp) (Ffig. Atodol 13A, Set Data Atodol 25). Fel y disgwyliwyd, roedd rheolyddion yn gysylltiedig yn agos mewn dadansoddiad cydrannau prif, tra bod cleifion myopathi nemaline TNNT1 yn arddangos amrywioldeb rhyng-samplau uwch tebyg i'r hyn a welwyd mewn dadansoddiad ffibr sengl (Ffig. Atodol 13B). Atgynhyrchodd dadansoddiad swmp y proteinau a fynegwyd yn wahanol (Ffig. Atodol 13C, Set Data Atodol 26) a phrosesau biolegol (Ffig. Atodol 13D, Set Data Atodol 27) a amlygwyd trwy gymharu ffibrau unigol, ond collodd y gallu i wahaniaethu rhwng gwahanol fathau o ffibrau a methodd â rhoi cyfrif am effeithiau clefydau heterogenaidd ar draws ffibrau.
Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos y gall proteomeg myoffibr sengl egluro nodweddion biolegol clinigol na ellir eu canfod gan ddulliau wedi'u targedu fel imiwnoblotio. Ar ben hynny, mae'r data hyn yn tynnu sylw at gyfyngiadau defnyddio teipio ffibr actin (MYH) yn unig i ddisgrifio addasiad ffenoteipig. Yn wir, er bod newid math ffibr yn wahanol rhwng myopathïau nemaline actin a throponin, mae'r ddau myopathi nemaline yn datgysylltu teipio ffibr MYH o fetaboledd ffibr cyhyrau ysgerbydol tuag at broteom cyhyrau cyflymach a llai ocsideiddiol.
Mae amrywioldeb cellog yn hanfodol i feinweoedd ddiwallu eu gofynion amrywiol. Mewn cyhyrau ysgerbydol, disgrifir hyn yn aml fel mathau o ffibrau a nodweddir gan wahanol raddau o gynhyrchu grym a blinder. Fodd bynnag, mae'n amlwg mai dim ond rhan fach o amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol y mae hyn yn ei esbonio, sy'n llawer mwy amrywiol, cymhleth ac amlochrog nag a feddyliwyd yn flaenorol. Mae datblygiadau technolegol bellach wedi taflu goleuni ar y ffactorau sy'n rheoleiddio ffibrau cyhyrau ysgerbydol. Yn wir, mae ein data yn awgrymu nad yw ffibrau math 2X o bosibl yn isdeip o ffibrau cyhyrau ysgerbydol penodol. Ar ben hynny, fe wnaethom nodi proteinau metabolaidd, proteinau ribosomaidd a phroteinau sy'n gysylltiedig â chelloedd fel prif benderfynyddion amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol. Trwy gymhwyso ein llif gwaith proteomig i samplau cleifion â myopathi nematod, fe wnaethom ddangos ymhellach nad yw teipio ffibrau yn seiliedig ar MYH yn adlewyrchu amrywioldeb cyhyrau ysgerbydol yn llawn, yn enwedig pan fydd y system wedi'i tharfu. Yn wir, waeth beth fo'r math o ffibr yn seiliedig ar MYH, mae myopathi nematod yn arwain at symudiad tuag at ffibrau cyflymach a llai ocsideiddiol.
Mae ffibrau cyhyrau ysgerbydol wedi cael eu dosbarthu ers y 19eg ganrif. Mae dadansoddiadau omics diweddar wedi ein galluogi i ddechrau deall proffiliau mynegiant gwahanol fathau o ffibrau MYH a'u hymatebion i wahanol ysgogiadau. Fel y disgrifir yma, mae gan ddulliau omics hefyd y fantais o fwy o sensitifrwydd ar gyfer meintioli marcwyr math o ffibr na dulliau traddodiadol sy'n seiliedig ar wrthgyrff, heb ddibynnu ar feintioli un marcwr (neu ychydig) i ddiffinio math o ffibr cyhyrau ysgerbydol. Defnyddiwyd llifau gwaith trawsgrifiomig a phroteomig cyflenwol ac integreiddiom y canlyniadau i archwilio rheoleiddio trawsgrifio ac ôl-drawsgrifio amrywioldeb ffibrau mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol dynol. Arweiniodd y llif gwaith hwn at fethu ag adnabod ffibrau pur o fath 2X ar lefel y protein yn vastus lateralis ein carfan o ddynion ifanc iach. Mae hyn yn gyson ag astudiaethau ffibr sengl blaenorol a ganfu <1% o ffibrau 2X pur mewn vastus lateralis iach, er y dylid cadarnhau hyn mewn cyhyrau eraill yn y dyfodol. Mae'r anghysondeb rhwng canfod ffibrau bron yn bur ar lefel mRNA a ffibrau 2A/2X cymysg yn unig ar lefel y protein yn ddryslyd. Nid yw mynegiant mRNA isoform MYH yn circadian,67 sy'n awgrymu ei bod yn annhebygol ein bod wedi "methu" y signal cychwyn MYH2 mewn ffibrau 2X sy'n ymddangos yn bur ar lefel yr RNA. Un esboniad posibl, er ei fod yn gwbl ddamcaniaethol, gallai fod gwahaniaethau mewn sefydlogrwydd protein a/neu mRNA rhwng isoformau MYH. Yn wir, nid oes unrhyw ffibr cyflym yn 100% pur ar gyfer unrhyw isoform MYH, ac nid yw'n glir a fyddai lefelau mynegiant mRNA MYH1 yn yr ystod 70–90% yn arwain at ddigonedd cyfartal o MYH1 a MYH2 ar lefel y protein. Fodd bynnag, wrth ystyried y trawsgriftom neu'r proteom cyfan, dim ond dau glwstwr gwahanol y gall dadansoddiad clwstwr eu nodi'n hyderus sy'n cynrychioli ffibrau cyhyrau ysgerbydol araf a chyflym, waeth beth fo'u cyfansoddiad MYH manwl gywir. Mae hyn yn gyson â dadansoddiadau gan ddefnyddio dulliau trawsgriftomig un-niwclews, sydd fel arfer yn nodi dim ond dau glwstwr myoniwclews gwahanol. 68, 69, 70 Ar ben hynny, er bod astudiaethau proteomig blaenorol wedi nodi ffibrau math 2X, nid yw'r ffibrau hyn yn clystyru ar wahân i weddill y ffibrau cyflym ac maent yn dangos dim ond nifer fach o broteinau sy'n doreithiog yn wahanol o'i gymharu â mathau eraill o ffibrau yn seiliedig ar MYH. 14 Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y dylem ddychwelyd at y safbwynt o ddechrau'r 20fed ganrif ar ddosbarthu ffibrau cyhyrau, a rannodd ffibrau cyhyrau ysgerbydol dynol nid yn dair dosbarth gwahanol yn seiliedig ar MYH, ond yn ddau glwstwr yn seiliedig ar eu priodweddau metabolaidd a chyfangol. 63
Yn bwysicach fyth, dylid ystyried amrywioldeb myoffibrau ar hyd sawl dimensiwn. Mae astudiaethau “omics” blaenorol wedi pwyntio i’r cyfeiriad hwn, gan awgrymu nad yw ffibrau cyhyrau ysgerbydol yn ffurfio clystyrau arwahanol ond wedi’u trefnu ar hyd continwwm. 11, 13, 14, 64, 71 Yma, rydym yn dangos, yn ogystal â gwahaniaethau mewn priodweddau cyfangol a metabolaidd cyhyrau ysgerbydol, y gellir gwahaniaethu myoffibrau gan nodweddion sy’n gysylltiedig â rhyngweithiadau cell-gell a mecanweithiau cyfieithu. Yn wir, gwelsom amrywioldeb ribosom mewn ffibrau cyhyrau ysgerbydol sy’n cyfrannu at amrywioldeb yn annibynnol ar fathau o ffibrau araf a chyflym. Mae achos sylfaenol yr amrywioldeb sylweddol hwn mewn myoffibrau, yn annibynnol ar fathau o ffibrau araf a chyflym, yn parhau i fod yn aneglur, ond gall bwyntio at drefniadaeth ofodol arbenigol o fewn ffasiglau cyhyrau sy’n ymateb yn optimaidd i rymoedd a llwythi penodol,72 cyfathrebu cellog neu benodol i organau arbenigol gyda mathau eraill o gelloedd yn y microamgylchedd cyhyrau73,74,75 neu wahaniaethau yng ngweithgaredd ribosom o fewn myoffibrau unigol. Yn wir, dangoswyd bod heteroplasmi ribosomaidd, naill ai trwy amnewid paralogaidd RPL3 ac RPL3L neu ar lefel 2′O-methyliad rRNA, yn gysylltiedig â hypertroffedd cyhyrau ysgerbydol76,77. Bydd cymwysiadau aml-omig a gofodol ynghyd â nodweddu swyddogaethol myoffibrau unigol yn datblygu ein dealltwriaeth o fioleg cyhyrau ar y lefel aml-omig ymhellach78.
Drwy ddadansoddi proteomau myoffibrau sengl gan gleifion â myopathïau nemaline, fe wnaethom hefyd ddangos defnyddioldeb, effeithiolrwydd a chymhwysedd proteomeg myoffibrau sengl i egluro patholeg glinigol cyhyrau ysgerbydol. Ar ben hynny, drwy gymharu ein llif gwaith â dadansoddiad proteomig byd-eang, roeddem yn gallu dangos bod proteomeg myoffibrau sengl yn cynhyrchu'r un dyfnder o wybodaeth â phroteomeg meinwe byd-eang ac yn ymestyn y dyfnder hwn drwy ystyried amrywioldeb rhyngffibrau a math myoffibrau. Yn ogystal â'r gwahaniaethau disgwyliedig (er amrywiol) yng nghymhareb y math o ffibr a welwyd mewn myopathïau nemaline ACTA1 a TNNT1 o'i gymharu â rheolyddion iach,19 fe wnaethom hefyd arsylwi ailfodelu ocsideiddiol ac allgellog yn annibynnol ar newid math o ffibrau a gyfryngir gan MYH. Mae ffibrosis wedi cael ei adrodd yn flaenorol mewn myopathïau nemaline TNNT1.19 Fodd bynnag, mae ein dadansoddiad yn adeiladu ar y canfyddiad hwn trwy ddatgelu hefyd lefelau uwch o broteinau allgellog sy'n gysylltiedig â straen a secretir, fel atecsinau, sy'n ymwneud â mecanweithiau atgyweirio sarcolemmal, mewn myoffibrau gan gleifion â myopathïau nemaline ACTA1 a TNNT1.57,58,59 I gloi, gall lefelau uwch o atecsinau mewn myoffibrau gan gleifion â myopathi nemaline gynrychioli ymateb cellog i atgyweirio myoffibrau atroffig difrifol.
Er bod yr astudiaeth hon yn cynrychioli'r dadansoddiad cyhyromeg cyfan ffibr sengl mwyaf o fodau dynol hyd yma, nid yw heb gyfyngiadau. Fe wnaethom ynysu ffibrau cyhyrau ysgerbydol o sampl gymharol fach a homogenaidd o gyfranogwyr ac un cyhyr (y vastus lateralis). Felly, mae'n amhosibl eithrio bodolaeth poblogaethau ffibr penodol ar draws mathau o gyhyrau ac ar eithafion ffisioleg cyhyrau. Er enghraifft, ni allwn eithrio'r posibilrwydd y bydd is-set o ffibrau uwch-gyflym (e.e., ffibrau 2X pur) yn dod i'r amlwg mewn sbrintwyr hyfforddedig iawn a/neu athletwyr cryfder79 neu yn ystod cyfnodau o anweithgarwch cyhyrol66,80. Ar ben hynny, roedd maint cyfyngedig y sampl o gyfranogwyr yn ein hatal rhag ymchwilio i wahaniaethau rhyw mewn heterogenedd ffibr, gan fod cymhareb math o ffibr yn hysbys i fod yn wahanol rhwng dynion a menywod. Ar ben hynny, nid oeddem yn gallu cynnal dadansoddiadau trawsgrifiomig a phroteomig ar yr un ffibrau cyhyrau neu samplau o'r un cyfranogwyr. Wrth i ni ac eraill barhau i optimeiddio dadansoddiadau cell sengl ac un myoffibr gan ddefnyddio dadansoddiad omics i gyflawni mewnbwn sampl isel iawn (fel y dangosir yma yn y dadansoddiad o ffibrau gan gleifion â myopathi mitocondriaidd), mae'r cyfle i gyfuno dulliau aml-omics (a swyddogaethol) o fewn ffibrau cyhyrau sengl yn dod yn amlwg.
At ei gilydd, mae ein data yn nodi ac yn egluro gyrwyr trawsgrifio ac ôl-drawsgrifio amrywioldeb cyhyrau ysgerbydol. Yn benodol, rydym yn cyflwyno data sy'n herio dogma hirhoedlog mewn ffisioleg cyhyrau ysgerbydol sy'n gysylltiedig â'r diffiniad clasurol o fathau o ffibrau sy'n seiliedig ar MYH. Rydym yn gobeithio adnewyddu'r ddadl ac yn y pen draw ailystyried ein dealltwriaeth o ddosbarthiad a amrywioldeb ffibrau cyhyrau ysgerbydol.
Cytunodd pedwar ar ddeg o gyfranogwyr Cawcasaidd (12 dyn a 2 fenyw) yn wirfoddol i gymryd rhan yn yr astudiaeth hon. Cymeradwywyd yr astudiaeth gan Bwyllgor Moeseg Ysbyty Prifysgol Ghent (BC-10237), cydymffurfiodd â Datganiad Helsinki 2013, a chofrestrwyd hi yn ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Cyflwynir nodweddion cyffredinol y cyfranogwyr yn Nhabl Atodol 1. Ar ôl cael caniatâd gwybodus llafar ac ysgrifenedig, cafodd y cyfranogwyr archwiliad meddygol cyn eu cynnwys yn yr astudiaeth yn derfynol. Roedd y cyfranogwyr yn ifanc (22–42 oed), yn iach (dim cyflyrau meddygol, dim hanes ysmygu), ac yn gymharol egnïol yn gorfforol. Penderfynwyd ar y cymeriant ocsigen mwyaf gan ddefnyddio ergomedr cam ar gyfer asesu ffitrwydd corfforol fel y disgrifiwyd yn flaenorol. 81
Casglwyd samplau biopsi cyhyrau wrth orffwys ac yn y cyflwr ymprydio dair gwaith, 14 diwrnod ar wahân. Gan fod y samplau hyn wedi'u casglu fel rhan o astudiaeth fwy, cymerodd y cyfranogwyr placebo (lactos), antagonist derbynnydd H1 (540 mg fexofenadine), neu antagonist derbynnydd H2 (40 mg famotidine) 40 munud cyn y biopsi. Rydym wedi dangos yn flaenorol nad yw'r antagonistiau derbynnydd histamin hyn yn effeithio ar ffitrwydd cyhyrau ysgerbydol wrth orffwys81, ac ni welwyd unrhyw glystyru sy'n gysylltiedig â chyflwr yn ein plotiau rheoli ansawdd (Ffigurau Atodol 3 a 6). Cynhaliwyd diet safonol (41.4 kcal/kg pwysau corff, 5.1 g/kg pwysau corff carbohydrad, 1.4 g/kg pwysau corff protein, ac 1.6 g/kg pwysau corff braster) am 48 awr cyn pob diwrnod arbrofol, a bwytawyd brecwast safonol (1.5 g/kg pwysau corff carbohydrad) fore'r diwrnod arbrofol. O dan anesthesia lleol (0.5 ml 1% lidocaîn heb epineffrin), cafwyd biopsïau cyhyrau o'r cyhyr vastus lateralis gan ddefnyddio sugniad Bergström trwy'r croen.82 Mewnosodwyd samplau cyhyrau ar unwaith yn RNAlater a'u storio ar 4°C nes eu bod yn cael eu dyrannu â llaw (hyd at 3 diwrnod).
Trosglwyddwyd bwndeli myoffibrau newydd eu hynysu i gyfrwng RNAlater ffres mewn dysgl diwylliant. Yna dyrannwyd myoffibrau unigol â llaw gan ddefnyddio stereomicrosgop a gefeiliau mân. Dyrannwyd pump ar hugain o ffibrau o bob biopsi, gan roi sylw arbennig i ddewis ffibrau o wahanol rannau o'r biopsi. Ar ôl dyrannu, trochwyd pob ffibr yn ysgafn mewn 3 μl o glustog lysis (Pecyn Lysis Celloedd SingleShot, Bio-Rad) yn cynnwys ensymau proteinase K ac DNase i gael gwared ar broteinau a DNA diangen. Yna cychwynnwyd lysis celloedd a chael gwared ar brotein/DNA trwy fortecsio byr, nyddu'r hylif mewn microcentrifuge, a magu ar dymheredd ystafell (10 munud). Yna deorwyd y lysad mewn cylchwr thermol (T100, Bio-Rad) ar 37°C am 5 munud, 75°C am 5 munud, ac yna ei storio ar unwaith ar -80°C tan brosesu pellach.
Paratowyd llyfrgelloedd RNA polyadenylated sy'n gydnaws ag Illumina o 2 µl o lysate myoffibr gan ddefnyddio'r Pecyn Paratoi Llyfrgell mRNA-Seq QuantSeq-Pool 3′ (Lexogen). Gellir dod o hyd i ddulliau manwl yn llawlyfr y gwneuthurwr. Mae'r broses yn dechrau gyda synthesis cDNA llinyn cyntaf trwy drawsgrifiad gwrthdro, lle cyflwynir dynodwyr moleciwlaidd unigryw (UMIs) a chodau bar i1 penodol i'r sampl i sicrhau cronni samplau a lleihau amrywioldeb technegol yn ystod prosesu i lawr yr afon. Yna caiff cDNA o 96 o myoffibrau ei gronni a'i buro â gleiniau magnetig, ac ar ôl hynny caiff RNA ei dynnu a pherfformir synthesis ail linyn gan ddefnyddio primerau ar hap. Caiff y llyfrgell ei phuro â gleiniau magnetig, ychwanegir tagiau i5/i7 penodol i'r pwll, ac ymhelaethir â PCR. Mae cam puro olaf yn cynhyrchu llyfrgelloedd sy'n gydnaws ag Illumina. Aseswyd ansawdd pob pwll llyfrgell gan ddefnyddio'r Pecyn Dadansoddi DNA Darn Bach Sensitifrwydd Uchel (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Yn seiliedig ar feintioli Qubit, casglwyd y pyllau ymhellach ar grynodiadau ecwimolar (2 nM). Yna dilyniannwyd y pwll canlyniadol ar offeryn NovaSeq 6000 yn y modd safonol gan ddefnyddio'r Pecyn Adweithydd NovaSeq S2 (1 × 100 niwcleotid) gyda llwyth o 2 nM (4% PhiX).
Mae ein piblinell yn seiliedig ar biblinell dadansoddi data QuantSeq Pool Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Yn gyntaf, dad-amlblecswyd y data gyda bcl2fastq2 (v2.20.0) yn seiliedig ar y mynegai i7/i5. Yna, dad-amlblecswyd Darlleniad 2 gydag idemux (v0.1.6) yn seiliedig ar y cod bar sampl i1 ac echdynnwyd dilyniannau UMI gydag umi_tools (v1.0.1). Yna, tociwyd y darlleniadau gyda cutadapt (v3.4) mewn sawl rownd i gael gwared ar ddarlleniadau byr (<20 o hyd) neu ddarlleniadau sy'n cynnwys dilyniannau addasydd yn unig. Yna, aliniwyd y darlleniadau â'r genom dynol gan ddefnyddio STAR (v2.6.0c) a mynegeiwyd ffeiliau BAM gyda SAMtools (v1.11). Tynnwyd darlleniadau dyblyg gan ddefnyddio umi_tools (v1.0.1). Yn olaf, perfformiwyd cyfrif aliniad gan ddefnyddio featureCounts yn Subread (v2.0.3). Perfformiwyd rheoli ansawdd gan ddefnyddio FastQC (v0.11.9) mewn sawl cam canolradd o'r biblinell.
Perfformiwyd yr holl brosesu a delweddu biowybodeg pellach yn R (v4.2.3), yn bennaf gan ddefnyddio llif gwaith Seurat (v4.4.0). 83 Felly, trawsnewidiwyd gwerthoedd UMI unigol a matricsau metadata yn wrthrychau Seurat. Tynnwyd genynnau a fynegwyd mewn llai na 30% o'r holl ffibrau. Tynnwyd samplau o ansawdd isel yn seiliedig ar drothwy lleiaf o 1000 o werthoedd UMI a 1000 o enynnau a ganfuwyd. Yn y pen draw, pasiodd 925 o ffibrau bob cam hidlo rheoli ansawdd. Normaleiddiwyd gwerthoedd UMI gan ddefnyddio'r dull Seurat SCTransform v2, 84 gan gynnwys yr holl 7418 o nodweddion a ganfuwyd, a chafodd gwahaniaethau rhwng cyfranogwyr eu hatchwelyd. Gellir dod o hyd i'r holl metadata perthnasol yn Set Ddata Atodol 28.
Amser postio: Medi-10-2025